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7.1 limma用于轉(zhuǎn)錄組reads-count數(shù)據(jù)差異基因分析

做轉(zhuǎn)錄組差異分析，我們通常是基于reads-count數(shù)據(jù)，這個(gè)數(shù)據(jù)可以來源于Salmon的結(jié)果、STAR的結(jié)果或從網(wǎng)上下載的數(shù)據(jù)。

這個(gè)數(shù)據(jù)怎么獲取，具體見下方的教程。

基于Salmon的轉(zhuǎn)錄組批量定量流程和差異分析
STAR直接就可以輸出readsCount，為什么還需要featurecounts？
利用R代碼從UCSC XENA下載mRNA, lncRNA, miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)并匹配臨床信息

7.1.1 輸入數(shù)據(jù)1：reads-count數(shù)據(jù)

現(xiàn)在假如我們已經(jīng)拿到了8個(gè)樣品的reads-count數(shù)據(jù)。點(diǎn)擊下載ehbio_trans.Count_matrix.txt。

這是TAB鍵分割的文本文件：

第一列是基因名字，基因名可以是ENSEMBL ID、Gene symbol或任意其它ID，但不允許有重復(fù)的名字。
第一行除第一列ENSG (第一列的名字可以是任意字符，不影響)外，其它列都是樣本名字。樣本名字建議只包括數(shù)字，字母和下劃線。尤其是不能有-，不能以數(shù)字開頭，最好下劃線都不要有。
數(shù)據(jù)矩陣中的其它內(nèi)容都是整數(shù)。
從第二行起，每一行代表一個(gè)基因在每個(gè)樣品里面的原始reads-count值。

##                 untrt_N61311 untrt_N052611 untrt_N080611 untrt_N061011
## ENSG00000227232           13            25            23            24
## ENSG00000278267            0             5             3             4
## ENSG00000241860            3            11             1             5
## ENSG00000279457           46            90            73            49
## ENSG00000228463            5             4            13             6
## ENSG00000237094            0            16             7             2
##                 trt_N61311 trt_N052611 trt_N080611 trt_N061011
## ENSG00000227232         12          12          22          22
## ENSG00000278267          2           4           3           1
## ENSG00000241860          3           2           0           2
## ENSG00000279457         52          46          89          31
## ENSG00000228463          5           0          11           4
## ENSG00000237094          1           3           3           2

7.1.2 輸入數(shù)據(jù)2：樣本分組信息 (sampleFile)

既然做差異基因分析，通常是2組或多組之間的比較。如果是多組，也是兩兩組之間的組合比較。在上面的reads-count矩陣中只有樣本名稱，但不知道哪些樣本是來源于一個(gè)生物處理組的，如對(duì)照組或處理組等。所以需要提供這樣一個(gè)文件，指示樣本的屬性信息，如所屬組信息。這里有一個(gè)示例數(shù)據(jù)，sampleFile2.txt:

##               conditions individual sizeFactor    SV1    SV2    SV3
## untrt_N61311       untrt     N61311  1.0211325 -0.101 -0.494 -0.316
## untrt_N052611      untrt    N052611  1.1803986  0.018 -0.170  0.588
## untrt_N080611      untrt    N080611  1.1796083 -0.429  0.376 -0.089
## untrt_N061011      untrt    N061011  0.9232642  0.535  0.241 -0.176
## trt_N61311           trt     N61311  0.8939275 -0.125 -0.496 -0.366
## trt_N052611          trt    N052611  0.6709229  0.036 -0.151  0.591

需要注意的有一下幾點(diǎn)：

樣本分組信息sampleFile文件至少需要有2列。
第一列表示樣本名字，需要與reads-count文件中的第一行中的樣本名字能對(duì)應(yīng)上。順序沒有關(guān)系。大小寫要一致。比如在sampleFile中樣本名寫做untrt_N61311，而在reas-count文件中寫做UNtrt_N61311或untrt N61311，大小寫不一致是不對(duì)的。一定注意是完全一致。
第二列表示樣本分組信息。示例中前4個(gè)文件屬于untrt組，后4個(gè)文件屬于trt組。一個(gè)組的樣本不要求必須挨著。樣本的組名不要有除數(shù)字，字母和下劃線之外的字符。
其它列都是樣本的屬性信息，可有可無。有時(shí)也會(huì)用到，后面會(huì)有例子演示。

7.1.3 導(dǎo)入數(shù)據(jù)，設(shè)置參數(shù)

表達(dá)矩陣通常比較大，在1M左右或更大，直接粘貼進(jìn)入瀏覽器的文本域會(huì)導(dǎo)致瀏覽器變卡。這不是網(wǎng)站速度慢的問題，是瀏覽器自身問題，不適合承載太大的數(shù)據(jù)。這里建議用上傳的方式，免費(fèi)注冊一個(gè)賬戶，按下圖所示上傳數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)上傳好之后，需要刷新工具頁面，才可以看到新上傳的數(shù)據(jù)。選擇相應(yīng)的數(shù)據(jù)，如下圖

依次設(shè)置參數(shù)：

Input way設(shè)置為Select uploaded file
Upload main expression data (Gene X Sample)選擇上傳的reads-count文件
Select sample attributes file (first column must match first row of expression data matrix)選擇上傳的sampleFile2.txt文件
選擇Expression data type為Raw reads count
選擇Group為conditions (sampleFile2.txt中表示分組的列)

其它參數(shù)可以暫時(shí)先不管。

點(diǎn)擊提交，獲得結(jié)果。

7.1.4 差異分析結(jié)果報(bào)告

默認(rèn)輸出一個(gè)結(jié)果文檔，1個(gè)大章節(jié)，2個(gè)小章節(jié)，分別是整體豐度圖譜比較和差異分析結(jié)果。點(diǎn)擊各個(gè)子章節(jié)可以展開查看具體內(nèi)容。

7.1.4.1 1.1 所有樣品豐度圖譜展示 (聚類熱圖和PCA)

1.1.1 是樣品表達(dá)圖譜聚類熱圖，一幅下三角熱圖，一幅交互式熱圖。展示樣本之間的相似性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)值也可從這下載。該工具主要定位是差異分析，可視化也有一些，不過都不能調(diào)整參數(shù)。如果需要進(jìn)一步可視化，可以基于這里提供的表達(dá)數(shù)據(jù)，通過BIC的其它工具進(jìn)行進(jìn)一步可視化分析。后面我們會(huì)講到。

Figure 7.3: 點(diǎn)擊理解圖形解讀 1. 這個(gè)熱圖上面的樹是根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系畫的嗎？ 2. 圖形解讀系列 | 給你5個(gè)示例，你能看懂常用熱圖使用嗎？

1.1.2 是樣本表達(dá)圖譜的PCA圖譜繪制（靜態(tài)圖和交互圖），在PC1軸上樣品按處理和對(duì)照分成2簇，在PC2軸上，樣品的分布與個(gè)體來源相關(guān)（這里是一個(gè)信號(hào)，我們后面會(huì)提到，感興趣的可以先看下高通量數(shù)據(jù)中批次效應(yīng)的鑒定和處理 - 系列總結(jié)和更新）。默認(rèn)出圖不太美觀，數(shù)據(jù)可以下載下來，用我們的PCoA工具進(jìn)行進(jìn)一步繪制。