三維超分辨顯微成像技術(shù)的研究進展

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1.  引言

傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像技術(shù)能夠清晰分辨出三維亞細胞結(jié)構(gòu)，這對細胞生物學(xué)研究來說是必不可少的。然而由于阿貝衍射極限的存在，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率受到了限制。

在可見光波段，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率僅為200～300nm，軸向分辨率為橫向分辨率的1/3～1/2，只能達到500～800nm。顯然，這兩個尺寸都遠大于許多亞細胞結(jié)構(gòu)。

于是，科學(xué)家們基于物理和化學(xué)方法提出了許多突破光學(xué)衍射極限的顯微成像技術(shù)。在眾多技術(shù)中，基于熒光標記的超分辨顯微成像技術(shù)將橫向分辨率和軸向分辨率分別提高了至少10倍和6倍，一躍成為當下的研究熱點。

熒光顯微成像技術(shù)都是通過熒光團的亮態(tài)(on state)和暗態(tài)(off state)，按時間順序記錄其亞衍射極限特性，并且熒光分子處于亮態(tài)或暗態(tài)的概率與激發(fā)光強呈非線性相關(guān)。通過對熒光團進行坐標定向或者隨機時間開關(guān)處理，熒光顯微鏡就能夠在亞衍射極限范圍內(nèi)清晰地分辨出熒光標記的細胞結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了從傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡到超分辨光學(xué)顯微鏡的轉(zhuǎn)變。通過此原理，科學(xué)家們也首次通過熒光顯微鏡進行了許多基本的生物學(xué)研究。

目前，超分辨顯微成像主要分為三種技術(shù)：第一種技術(shù)以受激輻射損耗 (STED)顯微術(shù)為代表。STED采用兩束激光，一束用于激發(fā)熒光分子產(chǎn)生熒光，另一束中心光強為零的環(huán)形損耗光用于損耗熒光并將發(fā)光區(qū)域限制在衍射極限以下，于是通過點掃描的方式即可實現(xiàn)超分辨成像。第二種技術(shù)以單分子定位顯微術(shù)(SMLM)為主，其代表性技術(shù)有光激活定位顯微鏡(PALM)和隨機光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(STORM)。SMLM 通過使用激活光和激發(fā)光控制成像區(qū)域中每次成像時僅有少量、隨機、離散的熒光分子發(fā)光，再通過高斯擬合得到每個熒光分子高精度的空間定位，最后將所有圖片進行疊加，形成一幅超分辨圖像。第三種技術(shù)是結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(SIM)。SIM 通過使用具有空間結(jié)構(gòu)的光束將空間高頻成分編碼到熒光圖像，再通過圖像算法解碼重構(gòu)出超分辨圖像。

理論上，SIM 的分辨率極限為傳統(tǒng)光學(xué)顯微術(shù)的兩倍，而 STED 技術(shù)和 SMLM 的分辨率沒有限制。

 

2. 受激輻射損耗顯微鏡的三維成像技術(shù)研究進展

在受激輻射損耗顯微成像中，中心光強為零的環(huán)形暗斑可以用來提高橫向分辨率，但由于軸向上并不能損耗熒光，軸向分辨率并未得到提升。此外，由于像差的存在，成像的深度也受限。因此，在三維成像中，提高軸向分辨率、增大成像深度、實現(xiàn)具有各向同性三維分辨率的深度成像至關(guān)重要。

2.1三維分辨率

根據(jù)STED的成像原理，要想提升顯微成像系統(tǒng)的三維空間分辨率，實現(xiàn)樣品的三維超分辨成像，關(guān)鍵是要讓損耗光在樣品焦平面處聚焦成一個三維中空暗斑，只有暗斑中心所在位置可以發(fā)出熒光，其他位置的熒光都被損耗了。要想實現(xiàn)這一點，目前的技術(shù)主要有基于單物鏡架構(gòu)的3D-STED 和基于雙物鏡架構(gòu)的isoSTED。

基于單物鏡架構(gòu)的3D-STED 的技術(shù)關(guān)鍵是對損耗光加載0/π環(huán)形相位(也叫作“Top-hat”相位)，這種相位分布可以讓損耗光經(jīng)過物鏡聚焦成具有焦面中心強度最小、焦面上下強度最大分布的三維暗斑。在這種架構(gòu)(z-STED)下，基于單物鏡架構(gòu)的3D-STED 技術(shù)相比于共聚焦顯微成像技術(shù)，可以獲得軸向6倍和橫向2倍的分辨率提升，即獲得90～110nm的近乎各向同性的三維分辨率。為了進一步增大橫向的損耗、提升橫向分辨率，可以通過再引入一路損耗光加載傳統(tǒng)的0～2π渦旋相位，產(chǎn)生一個橫向分布的“甜甜圈”形狀的環(huán)形暗斑，最終將兩個暗斑在焦面進行非相干強度疊加，得到橫向43nm和軸向125nm的分辨率。

                           

圖1：基于單物鏡架構(gòu)的3D-STED納米顯微技術(shù)原理圖

 

如圖1所示，損耗光經(jīng)過偏振分束器后分為水平偏振光STEDxy和垂直偏振光 STEDz，分別加載0～2π渦旋相位板和0/π環(huán)形相位板，二者隨后經(jīng)過偏振分束器合束，接著與激發(fā)光通過二色鏡合束，最終經(jīng)過光束掃描組件和1/4波片一起進入物鏡。

值得注意的是，為了保證兩束損耗光的非相干性并形成高質(zhì)量的三維暗斑，兩束損耗光脈沖在時間上有一定的延遲。

除了可以使用相位板對損耗光進行波前調(diào)制，也可以利用空間光調(diào)制器(SLM)對其進行波前調(diào)制。相位型的液晶空間光調(diào)制器往往只能對一種偏振光進行調(diào)制，這種偏振光的偏振方向與液晶取向一致。圖1展示了這樣的一種架構(gòu)：空間光調(diào)制器只對水平偏振光進行調(diào)制，其加載的第一個全息圖是0～2π渦旋相位，相位的第二個全息圖是0/π環(huán)形相位；水平偏振光STEDxy和垂直偏振光 STEDz，經(jīng)SLM第一個全息圖的調(diào)制后，只有損耗光STEDxy受到調(diào)制；兩束損耗光隨后依次經(jīng)過1/4波片、透鏡，再經(jīng)反射鏡原路返回經(jīng)過透鏡、1/4波片，此時原來的垂直偏振光STEDz已經(jīng)變成水平偏振光，受到SLM 第二個全息圖的調(diào)制，而原來的水平偏振光STEDxy已經(jīng)變成垂直偏振光，不再被SLM 調(diào)制。通過調(diào)節(jié)兩束損耗光的光強比，可以分別調(diào)節(jié)橫向和縱向的損耗能力，最終可以得到不同形狀的熒光點擴展函數(shù)(PSF)。

 

圖2：3D-STED 技術(shù)中的PSF結(jié)果

 

圖2展示了3D-STED 技術(shù)中激發(fā)光、損耗光和熒光 PSF在xy 和xz平面的強度分布。

值得注意的是，SLM的表面要和物鏡后焦面光學(xué)共軛。

此外，利用SLM 還可以很方便地對暗斑的形狀及位置進行控制，例如：可以通過澤尼克系數(shù)對損耗光波前進行補償，達到像差校正的目的；可以隨時切換到二維 STED模式 (兩個全息圖都加載0～2π 渦旋相位)；可以調(diào)節(jié)全息圖的大小以及環(huán)形相位的直徑以匹配不同的物鏡；可以通過加載光柵相位實現(xiàn)和激發(fā)光的自動對準。

基于雙物鏡架構(gòu)的isoSTED 的技術(shù)關(guān)鍵是損耗光通過兩個對置物鏡在樣品面發(fā)生干涉而形成暗斑。采用兩個對置物鏡的4Pi顯微鏡，對熒光樣品進行雙向激發(fā)和雙向探測，等效于在軸向上增大了物鏡的孔徑（得到近乎4π的空間立體角）,這樣可以減小PSF 的軸向大小，極大地提升軸向分辨率。

2002年，研究人員首次將 STED 與 4Pi技術(shù)相結(jié)合，獲得了33nm 的軸向分辨率。在這種被稱為“STED-4Pi”的顯微鏡中，通過對STED 光引入像差來消除聚焦暗斑除中心以外的其他極小值，從而消除熒光PSF沿軸向分布的旁瓣。進一步地，2008年研究人員提出的isoSTED 技術(shù)可以在此架構(gòu)下提升橫向分辨率，得到 40～45nm 的各向同性分辨率。

圖3：isoSTED的光學(xué)裝置

 

isoSTED 的光學(xué)裝置簡化示意圖如圖3所示，一束損耗光STEDxy通過0～2π渦旋相位板后經(jīng)偏振分束器分為兩路，二者分別進入兩個對置物鏡，在樣品面發(fā)生相長干涉，形成一個橫向分布的暗斑，產(chǎn)生橫向上的熒光損耗。另一束損耗光STEDz經(jīng)偏振分束器后分為兩路，二者分別進入兩個對置物鏡，在樣品面發(fā)生相消干涉，形成一個縱向分布的暗斑，產(chǎn)生縱向上的熒光損耗。最終，這兩個暗斑在樣品面進行非相干強度疊加，生成一個三維中空暗斑，如圖4所示。

 

圖4：isoSTED技術(shù)中的PSF結(jié)果

 

通過調(diào)節(jié)STEDxy和STEDz的光強比，最終可以得到一個近乎球形的熒光PSF。值得注意的是，為了避免這兩個暗斑在樣品面相互干涉、影響三維中空暗斑質(zhì)量，STEDxy和STEDz這兩束損耗光通常由兩臺激光器分別產(chǎn)生；此外，最終生成的三維中空暗斑在焦面上下有零值暗斑，使得此處的熒光不會被損耗掉，最終熒光PSF 在焦面上下會有兩個旁瓣，形成偽像，這個旁瓣可以在后期通過線性或非線性反卷積算法消除；另外，由于像差隨著深度的增加而增大，該技術(shù)只能成像深度在1μm 以內(nèi)的樣品。

2020 年，研究人員將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)用于isoSTED系統(tǒng)（AO isoSTED），以三維亞50nm 的分辨率對全細胞和組織樣品進行成像。AO isoSTED 技術(shù)和2008 年研究人員提出的isoSTED技術(shù)相比，有如下三方面的改進：1) STEDxy和STEDz來自同一激光器的不同偏振成分，并采用邁克耳孫干涉儀裝置對兩束光進行脈沖延遲以破壞其相干性，同時利用一個SLM對兩束光分別進行相位調(diào)制，對STEDz加載離焦相位，以有效地消除熒光PSF在焦面上下的旁瓣；2)在原來的兩條干涉臂各放入一片1/4波片，使得激光在進入物鏡前由原來的線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光，這樣可以降低激光對熒光分子選擇性激發(fā)與損耗的概率，同時減小圖像中激光導(dǎo)致的背景；3)在原來的兩條干涉臂各放入一個變形鏡，采用無傳感自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)對像差進行校正。

值得注意的是，盡管isoSTED技術(shù)實現(xiàn)了厚樣品成像，其三維分辨率也高于3D-STED技術(shù)，但是由于雙物鏡的對準要求極為嚴苛，其仍面臨系統(tǒng)復(fù)雜、搭建調(diào)試難度大的問題。

2016年，考慮到4Pi系統(tǒng)的高度軸向?qū)ΨQ性，北京大學(xué)Yang等提出鏡面增強超分辨顯微技術(shù)( MEANS)，用一面反射鏡取代樣品后面的載玻片，使得入射光和反射光在鏡面發(fā)生干涉，得到軸向110nm的分辨率，其與二維STED技術(shù)相結(jié)合( MEANS- STED)，可以在STED的基礎(chǔ)上進一步將橫向分辨率提升2倍，獲得19nm的橫向分辨率，但是其成像深度僅在離鏡面200nm范圍內(nèi)。

總的來說，使用單物鏡的鏡面增強超分辨顯微技術(shù)降低了iSoSTED技術(shù)的系統(tǒng)復(fù)雜度。

上述技術(shù)旨在通過縮小熒光發(fā)光區(qū)域即減小熒光PSF體積來提升成像時的三維分辨率。而膨脹顯微技術(shù)(ExSTED)首先通過化學(xué)手段對樣品進行各向同性的物理膨脹，然后進行成像，這樣三維分辨率得到提升，且提升的倍數(shù)與膨脹的倍數(shù)相當。進一步地, ExSTED技術(shù)結(jié)合了樣品膨脹顯微技術(shù)和STED超分辨顯微技術(shù)，可以得到亞10nm的二維分辨率和亞50nm的三維分辨率。值得注意的是，亞50nm的三維分辨率是采用水鏡得到的，這樣做是為了得到更大的成像深度，但如果采用油鏡的話，可以進一步提升三維分辨率，但折射率不匹配引起的球差會使得成像深度受限。

 

2.2三維成像深度

在三維成像應(yīng)用中，保持在不同深度處有較高的三維分辨率是很有必要的。成像深度往往受限于成像過程中的光散射和像差。此外，光散射和像差也會影響STED成像中激發(fā)光和損耗光的對準以及三維暗斑的質(zhì)量。為了減小成像過程中的光散射和像差，增大三維成像深度，主要從選擇合適物鏡、采用樣品清潔技術(shù)和使用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)這三個方面進行考慮。

 

在進行厚樣品的深度成像時，物鏡浸沒液和組織樣品的折射率不匹配會導(dǎo)致球差的產(chǎn)生，且球差隨著成像深度的增加而增加。雖然高折射率的浸沒液會讓物鏡擁有更大的數(shù)值孔徑，集光能力更強，理論上會帶來更高的成像分辨率，但是其和樣品折射率不匹配而導(dǎo)致的球差會降低成像質(zhì)量。因此，針對不同的組織樣品，選擇合適的物鏡浸沒液至關(guān)重要。在對富含脂質(zhì)的腦組織切片進行成像時，由于其折射率更接近甘油(折射率1.45)而不是水(折射率1.33)，因此選擇甘油物鏡更合適。此外，額外的校正環(huán)可以進一步補償折射率不匹配問題。2011年，研究人員使用帶校正環(huán)的甘油物鏡，對活腦切片進行成像，以二維60～80nm的分辨率揭示了突觸內(nèi)的肌動蛋白分布，成像深度可達120μm。在對活細胞成像時，由于其折射率更接近水(折射率1.33)而不是油(折射率1.518)，因此，選擇水鏡更為合適。此外，額外的自適應(yīng)光學(xué)元件，如空間光調(diào)制器，可以對損耗光的暗斑進行球差校正。2018年,研究人員利用水鏡，結(jié)合空間光調(diào)制器，在z-STED架構(gòu)下實現(xiàn)對活細胞樣品的成像，軸向成像深度可達37μm，軸向分辨率可達150nm，對充滿水的熒光珠成像時穿透深度可達180μm。在對膨脹樣品進行成像時，由于樣品存在于吸水膨脹后的凝膠之中，凝膠由水構(gòu)成，其折射率為1.33，因此選擇水鏡更為合適。2018年研究人員等在ExSTED中，選用NA為1.2的水鏡后成像深度由使用油鏡時的不到5μm增大到50μm，并獲得70nm的三維分辨率。

使用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)可以進一步校正由樣品折射率變化導(dǎo)致的像差。自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)通過動態(tài)校正元件（如空間光調(diào)制器和變形鏡），采用特定的像差測量技術(shù)和控制方法（如直接波前測量和間接像差優(yōu)化）來補償畸變的波前，提高成像質(zhì)量。將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)用于STED 顯微術(shù)時，空間光調(diào)制相比于變形鏡對光的偏振和波長敏感，因此常將其放置于損耗路，用來調(diào)制損耗光，而變形鏡常被放置于激發(fā)光、損耗光和熒光共同所在的光路，用來調(diào)制所有光束。

值得注意的是，為了保證調(diào)制效果，空間光調(diào)制器和變形鏡需要和物鏡后焦面呈光學(xué)共軛。

一種測量像差的方法是通過波前傳感器（如 Shack-Hartmann波前傳感器）來直接進行測量，但這種方法往往需要一個點狀的熒光目標作為“導(dǎo)星”；另一種測量像差的方法是通過間接進行像差優(yōu)化，按照一定的控制模式（如澤尼克系數(shù)）不斷改變動態(tài)校正元件的相位分布，獲取一系列圖像，并對每一幅圖像進行像質(zhì)評價（如圖像總強度或銳度），從而確定最佳的相位分布；此外，還可以通過測量不同深度的焦斑圖像，利用相位恢復(fù)算法，得到畸變的波前分布。

此外，將中空貝塞爾光束作為損耗光、高斯光束作為激發(fā)光的GB-STED 技術(shù)，充分利用中空貝塞爾光束的非衍射和自重構(gòu)特性，可以在類似腦組織灰質(zhì)的樣品約100μm 深度處成像，橫向分辨率約為100nm。

3. 單分子定位顯微鏡的三維成像技術(shù)研究進展

在單分子定位顯微成像中，熒光分子的橫向位置可以根據(jù)其圖像中類高斯分布的質(zhì)心確定?？墒菍τ谳S向定位，雖然可以通過離焦的光斑大小進行軸向定位，但是無像差的 PSF 關(guān)于焦平面對稱，這使得 PSF 在焦平面兩側(cè)距離相同的位置處是相同的，無法確定離焦方向。除此之外，PSF的軸向位置變化靈敏度較低、離焦信號信噪比較低、定位深度依賴于系統(tǒng)景深等問題也亟須解決。

圖5：無像差的 PSF 在不同軸向位置的圖像

 

圖5為無像差的PSF 在不同軸向位置的圖像。于是，人們提出了多種三維成像技術(shù)來提高SMLM 的軸向分辨能力、增大成像深度，例如 PSF工程、多位置觀測、超臨界角熒光和4Pi顯微鏡等其他方法。

3.1PSF工程

由于無像差的PSF在焦平面兩側(cè)是具有對稱性的，那么可以人為改變PSF的空間分布，將PSF的軸向位置信息編碼到PSF的橫向形狀上，并通過橫向形狀進行軸向定位。這類方法被統(tǒng)稱為PSF工程。

3.1.1  像差

由于無像差的PSF在焦平面兩側(cè)具有對稱性，那么在PSF中引入不具有對稱性的像差就可以打破這種局面，實現(xiàn)軸向定位。早在1994年，研究人員通過在PSF中引入像散，實現(xiàn)了單個熒光顆粒的三維示蹤(SPT)，軸向分辨率可達12nm。

圖6：3D STORM示意圖

 

基于此技術(shù)，2008年研究人員實現(xiàn)了3D-STORM。如圖6所示,在傳統(tǒng)的熒光成像光路中，他們在物鏡( objective)和筒鏡( imaging lens)之間加入了一個焦距為1m的柱透鏡( cylindrical lens)使得圖像在x和y方向受到不同程度的調(diào)制。于是，熒光分子的PSF橢圓度和方向隨著軸向位置的變化而變化。當熒光分子恰好在平均焦平面時，PSF在x和y方向上具有相等的寬度，圖像呈圓形；當熒光分子在其他位置時，PSF在x和y方向上聚焦程度不同，圖像呈橢圓形。因此，如果標定好PSF在x和y方向上寬度關(guān)于z的變化曲線(校正曲線)，那么只需要測量PSF在這兩個方向上的寬度就可以確定熒光分子的軸向位置。

在繪制校正曲線時，首先使量子點或熒光分子稀疏地附著在蓋玻片表面，保持樣品臺不動，在z方向移動物鏡以恒定速率進行掃描，得到不同軸向位置的PSF。然后使用二維橢圓高斯函數(shù)進行擬合，得到PSF中心坐標以及x和y方向的寬度。使用離焦函數(shù)進行擬合，并對折射率不匹配進行修正，最終可以得到校正曲線。

由于柱透镋改變了PSF的形狀，橫向擬合誤差增大,x和y方向的分辨率大致為20～30nm，略低于傳統(tǒng)2DSTORM。x方向的分辨率大致為50～70nm，約為x和y方向的2～3倍。

此方法光路較為簡單，成本低，是目前最受歡迎的方法。當然，引入像散的缺點也很明顯。單次成像的定位深度較淺，通常限制在距離平均焦平面±350nm的范圍，要對厚生物樣品進行成像依賴于軸向掃描，因為距離基準面越遠，PSF逐漸展寬，信噪比會變低。并且，樣品和物鏡之間折射率的不匹配會產(chǎn)生球差，這使得在距離基準面越遠位置的球差影響越大。但是值得注意的是，在基準面以下，球差影響較小。另外，選擇柱透鏡的焦距時，需要在像散強度和信噪比之間進行權(quán)衡，像散越強，橫向PSF對于軸向位置變化的分辨率就會越高，具有深度信息的橫向PSF對軸向位置變化的靈敏度就會越高，但是信噪比也會越低。若想同時

保證信噪比和軸向成像深度，可以使用雙物鏡,2012年研究人員在此系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，將單物鏡改為雙物鏡，光子利用效率提升了兩倍，單分子定位精度在橫向和軸向分別為4nm和8nm。在對肌動蛋白絲進

3.1.2  自干涉

2018年研究人員提出了自干涉三維超分辨顯微鏡(SELFI)。SELFI的原理如下：對于焦點平面附近的熒光分子，所收集的熒光的波前曲率很大程度上取決于分子的軸向位置，并且在焦點處表現(xiàn)出曲率符號反轉(zhuǎn)。因此，在成像平面中，通過干涉測量對熒光波前進行分析，可以得到熒光分子的軸向位置。他們通過在距離像面幾微米的位置處加入一個相位衍射光柵對PSF 進行改進，產(chǎn)生了一種空間重疊度大于90%的自相干PSF，它的干涉圖案隨著熒光分子的軸向位置的變化而改變，并且干涉圖案的包絡(luò)線對應(yīng)著原始PSF的橫向分布。因此，根據(jù)干涉圖案就可以進行三維定位。而且，SELFI對像差不敏感，可以讓3D MLM 深入完整組織內(nèi)部進行三維成像。于是，他們把SELFI與像散技術(shù)進行了比較，結(jié)果表明在成像深度大于10μm 時，像散技術(shù)的軸向定位精度明顯下降，但是SELFI依舊保持著各向同性的定位精度。隨后，他們使用SELFI對厚樣品中肌動蛋白和 OCT4 進行三維成像，其中在對 OCT4進行成像時，SELFI揭示了OCT4在未清除的組織球體內(nèi)部深達50μm 的空間分布，這也證明了SELFI具有對厚樣品進行三維成像的能力。2019年他們實現(xiàn)了 SELFI的活細胞三維成像。當然，SELFI的軸向定位深度相比于像散技術(shù)并沒有很大提升，可以實現(xiàn)700nm(±350nm)深度下的軸向定位。

3.1.3  傅里葉面調(diào)制

為了解決成像深度較淺的問題，2009 年 研究人員報道了一種使用雙螺旋PSF(DH-PSF)進行三維成像的技術(shù)。如圖7所示，在4f 系統(tǒng)中，他們使用SLM 在傅里葉面對 PSF 進行調(diào)制，通過在模態(tài)平面疊加特定的高斯-拉蓋爾模式，使PSF 擁有類似于DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)。在距離焦平面不同深度的位置上，DH-PSF 兩個主瓣之間連線與水平方向夾角的不同，反映了熒光分子軸向位置的變化。與像散的方法一樣，在繪制校正曲線后，就可以確定熒光分子的軸向位置。

對于單顆粒成像，這種方法的成像深度可以達到2μm，三個方向的分辨率都可以達到10～20nm，并且使用最大似然估計法時，分辨率還可以繼續(xù)提高。但是 DH-PSF 旁瓣(side lobes)的能量占用和SLM 的能量損失，導(dǎo)致光子利用效率較低，需要較長的曝光時間才能提高定位精度，因此這種方法只適用于高亮度的熒光染料和熒光蛋白。若想要減少SLM 的能量損失并對細胞結(jié)構(gòu)進行成像，則可以使用專門定制的相位板（phase mask）代替 SLM，DH-PSF 被廣泛地用于生物樣品(如微管)的成像，其橫向和軸向分辨率分別能達到20nm和30nm，成像深度最大可以達到2.5μm。

后來，人們基于理論或者實驗調(diào)制出了多種PSF，用于增大成像深度、提高定位精度，例如：phase ramp PSF、corkscrew PSF、self-bending PSF、saddle-point PSF、tetrapod PSFs、 bisected PSF、Airy-beam PSF和 twin-Airy PSF等。

3.2多位置觀測

PSF 的橫向尺寸在焦平面附近變化緩慢，僅憑單獨的2D PSF 擬合很難確定其軸向位置。因此，除了采用 PSF 工程修改 PSF 形狀，也可以通過在物方或者像方的不同位置進行同時成像，從中提取物體的軸向位置。

3.2.1  雙平面

圖7：dMUM 和 MUM 系統(tǒng)示意圖

 

如圖7所示的多焦面顯微鏡(MUM)和雙物鏡多焦面顯微鏡(dMUM)，用于提升三維成像的軸向分辨能力。對于 MUM，當兩個探測器分別位于焦平面(0nm)和遠離焦平面(500nm)的位置時，對于同一個分子發(fā)出的熒光信號，探測器接收到的信號強度是不同的，換而言之就是橫向PSF 的形狀不同。因此，可以通過實驗測得深度和PSF 形狀(信號強度分布)之間的關(guān)系，確定熒光分子的軸向位置，或者可以通過 PSF 模型的理論計算進行定位。相對于傳統(tǒng)顯微鏡，MUM 提升了焦平面附近的定位精度，為增大定位深度，可以繼續(xù)增加平面?zhèn)€數(shù)、增大間距，但是每個探測器分配到的光子數(shù)也會減少，導(dǎo)致定位精度下降，因此通常將 MUM 和其他方法相結(jié)合以彌補不足，例如艾里光束 PSF。dMUM 使用了類似于 4Pi 和I5M的雙物鏡結(jié)構(gòu)，提高了光子利用效率，定位精度得到進一步提升，在SPT 中的軸向定位精度最高可以達到10nm 左右，定位深度可達1～2μm。但是相比于 MUM，dMUM 的系統(tǒng)復(fù)雜度較高。

另外需要注意的是,MUM 和 dMUM 都存在著一個問題，對于NA較大的物鏡，對偏離物鏡和管鏡預(yù)設(shè)的焦平面進行成像會引入球差和其他高級像差，影響定位精度，并且在偏移較大的情況下像差的影響會加重。

3.2.2  多平面

為減小多平面觀測中像差的影響，可以使用定制的衍射光學(xué)器件將物體發(fā)出的光衍射為多個級次,并同時無像差地成像在同一平面的不同位置上，不同級次衍射光的相位不同，對應(yīng)著不同位置的平面，如圖8所示。

圖8：使用畸變衍射光柵和透鏡進行成像

 

一種像差校正的多焦點顯微鏡(MFM)，設(shè)計了一種多焦點衍射光柵，將熒光衍射為9個級次，即得到了9 個間距相同的平面。使用 MFM 對 RNA聚合酶II的異質(zhì)核遷移進行三維示蹤，單次成像深度可以達到 4μm。相比于dMUM使用雙物鏡和MUM使用多個分束鏡產(chǎn)生多個平面的方法，MFM的系統(tǒng)較為簡單，只需在4f系統(tǒng)的傅里葉面加入多焦點衍射光柵即可。

圖9：MFM系統(tǒng)示意圖

 

2014年研究人員將MFM(圖9)應(yīng)用于 STORM/PALM中，實現(xiàn)了多色3 D SMLM全細胞成像。他們對哺乳動物線粒體網(wǎng)絡(luò)和酵母微管進行了成像，單次成像的定位深度可達4μm，橫向和軸向分辨率分別為20nm和50nm。但是，多焦點衍射光柵的衍射效率較低，9個級次的理論極限僅為67%左右，想要提高光子利用效率，可以增加衍射級次或者使用多重相位光柵代替原本的二元光柵，從而可將9個級次的光子利用效率提升至74%，甚至更高。由上可知，想要增大單次成像的定位深度，最直接的辦法就是增加平面?zhèn)€數(shù)。但是，這也需要在定位精度和平面?zhèn)€數(shù)之間權(quán)衡，平面?zhèn)€數(shù)的增多會讓每個平面分配到的光子數(shù)減少，導(dǎo)致每個平面的定位精度降低。換而言之，位于特定平面上的熒光分子是這些圖像中某個子集的焦點，同時在其他熒光分子進行定位時熒光分子又是背景噪聲，用于提升定位精度的光子個數(shù)僅占探測到總光子數(shù)的小部分。因此，雙/多平面技術(shù)直接應(yīng)用于細胞結(jié)構(gòu)的3 D SMLM成像具有一定難度，因此多平面技術(shù)也通常和其他技術(shù)(如像散)進行結(jié)合并且也在3D SPT成像中應(yīng)用廣泛。

 

3.2.3  多角度

另一種實現(xiàn)在不同位置同時觀測的方法就是多角度觀測，此方法通常表現(xiàn)為在樣品基底加入微反射鏡、增加視場角或成像光路引入視差。

（1）  增加視場角

2009年，研究人員次使用錐形微反射鏡孔基底對直徑為190nm 的聚苯乙烯顆粒進行高速3D SPT 成像，三維定位精度達到了20nm。如圖10所示，當顆粒發(fā)生軸向移動時，雖然其不影響對顆粒的直接成像，但是熒光在微型反射鏡的入射點是上下移動的，使得顆粒的反射成像在橫向上移動，即微型反射鏡將軸向位移轉(zhuǎn)化為橫向位移，并且結(jié)合其他位置的反射成像實現(xiàn)軸向定位。

圖10：錐形微反射鏡孔三維成像原理圖

 

基于此技術(shù)，2010年研究人員提出了一種虛體積超分辨成像顯微鏡(VVSRM)，并將其應(yīng)用于PALM/FPALM 和PAINT。如圖11所示，他們制作了一種反射鏡基底，傾斜的反射鏡可以對熒光分子側(cè)面進行反射成像，通過分束鏡和輔助透鏡可將實像和離焦的反射像同時成像在同一個平面上，再對橫向定位的結(jié)果進行坐標變換，即可實現(xiàn)軸向定位。當反射鏡傾斜角度為45°時，理論上可以實現(xiàn)空間上各向同性的分辨率，各向同性也使得其體積測量的準確度高于共聚焦顯微鏡。若光子數(shù)超過5000，則定位精度能達到亞20nm。

 

圖11：VVSRM系統(tǒng)示意圖

 

不難看出在VVSRM 中加入反射鏡基底，不但補償了分束鏡帶來的能量損失，而且減小了軸向漂移和像差的影響。然而，反射鏡基底也帶來了不利的因素，例如樣品制備的難度增大。

（2）  引入視差

最早引入視差的方法通常是在物鏡后焦面或者后焦面的共軛面加入楔形棱鏡或者反射鏡以將成像光路按角度分成兩個通道,使得物體的軸向位移表現(xiàn)為兩個橫向圖像之間相對位置的改變，在 3D SPT中都可以達到納米級的精度。圖12 為反射鏡三維成像示意圖。

圖12：反射鏡三維成像示意圖

 

2019年，研究人員首次提出傅里葉光場顯微鏡(FLFM)。他們通過將微透鏡陣列放在成像光路的傅里葉面上的方法引入視差，實現(xiàn)了小鼠腎臟切片的傳統(tǒng)三維顯微成像3～5μm 的分辨率。2020年研究人員將此技術(shù)引入 SMLM 中，并將其命名為單分子光場顯微鏡(SMLFM),分辨率得到了顯著提升。如圖 13 所示，在探測器的接收面上，MLA 將成像光路在橫向上劃分為二維陣列，陣列的每個區(qū)域都可以測量光場的四維信息以及二維空間和角度信息。每個微透鏡都會對物體的一部分波前進行成像，若物體發(fā)生軸向位移，則在陣列的不同區(qū)域，其圖像的橫向位置會朝著孔徑波前平均梯度的方向移動，并且位移長度與平均梯度成比例關(guān)系。例如，當物體靠近物鏡，圖像向陣列中心外側(cè)移動；反之，圖像向中心內(nèi)側(cè)移動。通過理論模型進行計算即可獲取軸向位置信息，因此微透鏡陣列可以測量光場的五維信息。

圖13：SMLFM系統(tǒng)示意圖

 

3.3超臨界角熒光

樣品和玻璃界面之間存在折射率不匹配的情況，這對在分界面附近的熒光分子輻射角度分布有很大影響。在距離分界面的一定范圍內(nèi)，熒光分子輻射的一部分熒光會以低于臨界角的范圍射入玻璃，稱為低臨界角熒光(UAF)；另一部分熒光則會以超過臨界角的范圍入射，稱為超臨界角熒光(SAF)。根據(jù)折射定律，在幾何光學(xué)中SAF 是不可能存在的，SAF 也因此被稱為“禁止的光線”。但是，從物理光學(xué)的角度分析，熒光分子所輻射的倏逝分量會在分界面另一側(cè)的介質(zhì)(如玻璃)中傳播，并且會隨著熒光分子和分界面的距離的增加而急劇下降。因此，SAF 的能量貢獻會隨著此距離的增加而急劇下降，而在此范圍內(nèi) UAF 的能量貢獻幾乎不變。

 

圖14：SAF原理圖

 

如圖14 所示，當熒光分子與分界面(z=0nm)接觸時，SAF光子數(shù)大致等于總光子數(shù)的一半；當熒光分子與分界面距離大于等于λ(z≥λ)時，SAF光子數(shù)幾乎為0，并且光子數(shù)隨著其與分界面距離的增加呈指數(shù)形式下降。

 

3.3.1  SAFM

基于此原理，2004年研究人員首次提出超臨界角熒光顯微鏡(SAFM)，用于在共聚焦顯微鏡中同時分析熒光分析物表面結(jié)合和未結(jié)合部分的相關(guān)信息。2010年他們提出3D-SAFM技術(shù)，并將其應(yīng)用在三維顯微成像中。如圖15所示，在3D-SAFM中，SAF和UAF分別由拋物面型聚光器和物鏡收集，,角度范圍分別為60°～75°(最小角度可通過光闌調(diào)節(jié))和0°～24°。在一定范圍內(nèi)，UAF的能量分布與激光相同，相比于SAF幾乎沒有改變，因此可以使用SAF和UAF的比值和軸向位置的關(guān)系進行定位，而且SAF還避免了外界因素對成像釆集過程中漂移的影響。

圖15：3D SAFM原理圖

 

3.3.2  DONALD

2015 年研究人員將dSTORM 與SAFM結(jié)合，提出一種可直接進行軸向定位探測的光學(xué)納米顯微系統(tǒng)(DONALD)。在 DONALD 中，他們使用高數(shù)值孔徑(0.49NA )的物鏡來收集包含 SAF在內(nèi)的落射熒光，在成像光路的 DONALD 模塊中，落射熒光被分束鏡分為兩部分，一部分為 SAF 和UAF，另一部分為UAF(SAF 被光闌阻擋)。因為在高 NA 物鏡的后焦面(共軛面)上，SAF 和遠場UAF 在徑向上是分開的，所以可以將 UAF 和SAF 分開。這樣在 EMCCD 平面上，可以通過將落射熒光與 UAF 相減得到 SAF，再計算SAF 與 UAF 的比值，實現(xiàn)軸向定位。理論上，DONALD可以實現(xiàn)5～10nm 的軸向定位精度。但是，在實際成像時，DONALD 的軸向定位精度可以達到約15nm；在對細胞結(jié)構(gòu)(如細胞纖維型肌動蛋白和微管)成像時，軸向分辨率為40～80nm，且隨著深度的增大，分辨率逐漸降低。這是因為分束器導(dǎo)致 UAF 和 SAF 的能量都被舍棄了50%，用于軸向定位的光子數(shù)減少，信噪比降低，外加像差的影響，DONALD 的定位精度和理論值有所差距。

 

3.3.3  dSLAM

圖16：dSALM系統(tǒng)示意圖

 

如圖 16 所示，在 dSALM 的系統(tǒng)中，研究人員使用一種定制的橢圓形反射鏡在后焦面上將SAF 從落射熒光中直接分離出來。在 UAF 所在光路中，他們通過加入柱透鏡引入較弱的像散，用于橫向定位和精度較低的軸向定位。在定位算法方面，dSALM 的直接分離法讓其定位精度得到 4 倍的提高、有效景深得到4倍的增大。在對熒光珠的3D成像和DNA 折紙四面體的3D DNA-PAINT成像中，各個方向上的定位精度均為4～5nm，分辨率可以達到30nm；在對細胞網(wǎng)格蛋白小窩和微管的3D DNA-PAINT 成像中，分辨率可以達到50nm。此方法雖然提升了定位精度，但是dSALM 引入了弱像散，導(dǎo)致成像深度較大時定位精度無法得到保證，因此其單次成像定位的深度較小，實驗中最大成像深度為600nm。

此外，dSALM 使用高數(shù)值孔徑(1.7NA)物鏡所需的高折射率油鏡，導(dǎo)致其無法使用光激活熒光染料；較大的視場像差將視場限制在20μm。

當然，除了使用分離 UAF 和 SAF 的方法進行三維成像，還可以使用其他系統(tǒng)結(jié)構(gòu)較為簡單的方法，例如離焦。但是，離焦產(chǎn)生的像差會影響定位精度和校正曲線的繪制。

 

3.4 4Pi顯微鏡

由于單個物鏡最多只能收集一半球形波前，在不犧牲橫向分辨率的情況下，很難實現(xiàn)軸向分辨率的提升。但是，如果可以在成像系統(tǒng)的焦平面的另一側(cè)上也放置一個物鏡(共焦面物鏡)收集波前的另一半，這樣可以得到近乎完整的球形波前，由于恢復(fù)了對稱性，PSF 的軸向延展也會大大減小，各向同性分辨率也因此實現(xiàn)，并且收集的光子數(shù)也提升了1倍。

圖17：4Pi-SMLM 系統(tǒng)示意圖

 

基于此理念,在20 世紀90 年代 研究人員提出了4Pi顯微鏡(4Pi microscopy)。如圖17所示，因為一個物鏡在理論上最多可以覆蓋空間立體角的一半(2π)，所以兩個相對的物鏡可以實現(xiàn)全空間立體角(4π)，故將其命名為4Pi顯微鏡。實際上，空間立體角通?？梢詫崿F(xiàn) 2.5π~3π。在SMLM中使用4Pi可將干涉條紋中的相位信息轉(zhuǎn)化為軸向位置信息，進而提高軸向分辨率，目前已經(jīng)實現(xiàn)了4通道同時記錄相位信息的成像系統(tǒng)。

 

3.4.1  iPALM

圖18：iPALM系統(tǒng)示意圖

 

2009 年研究人員首次將 PALM 與 4Pi結(jié)合，并將其命名為干涉測量型 PALM(iPALM)。如圖18所示，iPALM使用3通道分束器將熒光分成3個光束并產(chǎn)生自干涉，且每個通道之間的相位差為π/3，找到每幀圖像中熒光分子的中心即可實現(xiàn)橫向定位；對于軸向定位，同時獲取3個通道中同一熒光分子的強度并通過強度與軸向位置的關(guān)系曲線，即可得到該分子的相對軸向位置，最終實現(xiàn)三維定位。iPALM 的 橫向和軸向定位精度分別為20nm 和10nm，對生物細胞結(jié)構(gòu)進行三維成像時可以達到20nm 以下的三維分辨率，因此iPALM可以清晰分辨出細胞微管、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞結(jié)構(gòu)，在這其中軸向分辨率最高可以達到10nm左右。當然，iPALM 也有局限性，由于他們把熒光波前當作平面波來分析，iPALM 的成像定位深度較小，僅為225nm。若想擴大軸向定位范圍，則可以將iPALM 與其他技術(shù)相結(jié)合，不過其他技術(shù)的缺陷也可能會被引入其中。

 

3.4.2  4Pi-SES

2008年研究人員首次提出了將4Pi應(yīng)用于SMLM 的方案，并且提出了4通道分束器的概念。對于單個分子定位，此方案理論上可以實現(xiàn)5～10nm 的三維分辨率。2011年，他們報道了4Pi單分子開關(guān)顯微鏡，并成功實現(xiàn)了雙色三維成像。4Pi-SMS采用了一種三角形4Pi腔，4Pi干涉腔的每個臂上都加入了一個1/4 波片(光軸與安裝面呈45°)和巴比涅-索雷補償器,使得p偏振光相對于s偏振光分別產(chǎn)生 Δ?a 和 Δ?b 的相位延遲，并且保證 Δ?a-Δ?b=π/2。最終，通過傾斜反射鏡在空間上將熒光根據(jù)偏振態(tài)和傳播方向分成4個通道并同時成像在同一相機上。對于軸向定位范圍超過λ/2的熒光分子，分子的軸向位置之差為λ/2 的整數(shù)倍時，會導(dǎo)致干涉圖案相同，使得軸向定位不準確，進而導(dǎo)致圖像中包含軸向偏移的偽像。為此，他們不僅計算了相機上熒光分子高斯加權(quán)強度的全局相位，還計算了其高斯加權(quán)第三中心矩陣的全局相位。因此，在成像深度為1.5λ(～650nm)時，4Pi-SMS的軸向分辨率至少為5.4～6.6nm，橫向分辨率為8.3～22.3nm。于是,4Pi-SMS被應(yīng)用于人體血小板和哺乳動物微管的三維成像中，成像深度為700～1000nm。此外，相比于iPALM，4Pi-SMS 的多色成像也較容易實現(xiàn)，只需在原本的光路中加入一個二向色鏡，通過透過率和不同偏振態(tài)之間的關(guān)系以及兩種偏振態(tài)的能量比率判斷染料種類，實現(xiàn)多色成像。

 

3.4.3  W-4PiSESN

為了進一步增大成像深度， 2016年研究人員提出了一種全細胞4Pi單分子開關(guān)納米顯微鏡 (W-4PiSMSN)。雖然前人解決了厚度大于250nm的樣本存在偽像的問題，但是若想實現(xiàn)對厚度為5～10μm 的哺乳動物的全細胞成像，4Pi-SMS依然會受到定位密度和像差的影響。

圖19：W-4PiSMSN系統(tǒng)示意圖

 

如圖19所示，為了在哺乳動物細胞的全厚度上實現(xiàn)10～20nm 的三維分辨率，他們改進了4Pi-SMS的系統(tǒng)設(shè)計，在4Pi干涉腔的每個臂中都加入了可變形鏡，用于校正系統(tǒng)的各種像差和優(yōu)化 PSF；其次，他們根據(jù)Brown等提出的4Pi-PSF 偏心距分析算法進行改進，將4Pi-PSF 的干涉相位(可以進行精確的軸向定位,不能區(qū)分干涉峰)及其包含像散的偏心距(可以將軸向定位范圍縮小到每個干涉峰,不能提供干涉精度)所提供的信息共同用于軸向定位。因此，使用 W-4PiSMSN 對噬菌體、核孔和纖毛等細胞結(jié)構(gòu)進行大體積三維成像，其三維分辨率均可達到10～20nm,并且成像深度可達10μm左右。

綜上所述，4Pi-SMS的確可以實現(xiàn)很高的分辨率，相比于其他技術(shù)有很大的優(yōu)勢。但是，4Pi-SMS的系統(tǒng)復(fù)雜程度較高，成本較高，搭建周期長(通常為1年)，存在較多的不穩(wěn)定性，因此全世界僅有少數(shù)實驗室擁有4Pi-SMS，這也限制了4Pi-SMS在世界各地生物實驗室中的廣泛應(yīng)用。

參考資料：

王瀟，涂世杰等， 三維超分辨顯微成像技術(shù)的研究進展，激光與光電子學(xué)進展

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